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超高压灭活流感病毒的免疫原性研究

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【摘要】 目的检测超高压灭活的流感病毒FM1株的免疫原性。方法采用超高压技术(300 mPa，2.5 h)灭活甲型流感病毒FM1株。取ICR小鼠60只，用于病毒免疫性实验及免疫保护试验各30只。分别进行抗体检测、T淋巴细胞转化试验，并计算感染后小鼠的肺指数和肺指数抑制率。结果压力灭活组和病毒对照组小鼠抗体产生量、T淋巴细胞刺激指数均显著高于正常对照组(P<0.01);压力灭活组小鼠肺指数显著低于病毒对照组(P<0.01)。结论超高压技术灭活的流感病毒FM1株保留了很好的免疫原性。

【关键词】 超高压;流感病毒;免疫原性

疫苗接种是当今防止流感发生和流行最有效的一种手段〔1〕。在我国目前使用的流感疫苗为第一代疫苗，其中全病毒灭活疫苗虽然免疫效果好，但因为发生副反应的几率高，且存在制备过程复杂和安全性等问题不适宜儿童和老年人接种。超高压(High Hydrostatic Pressure，HHP)是指超过100 mPa的压力，作为一种有效的灭菌消毒的物理手段已成功地应用于生物工程的多个领域〔2～4〕，采用超高压技术灭活病毒可以提供一个完整的病毒颗粒，这种病毒颗粒不仅丧失了原来的感染性且很好的保持了病毒的免疫原性，制备过程简单，不添加化学制剂，在一定程度上降低了副反应的发生。国外已用该技术开展了动物疫苗的研制工作〔4，5〕，但用于流感疫苗的研究尚未见报道。

　　本课题组已经采用超高压技术灭活了流感病毒FM1株，并已确定了其灭活的适宜条件〔6〕。本研究采用超高压灭活的流感病毒免疫小鼠，检测其免疫效果，从而为进一步探讨用超高压方法制备流感疫苗的可行性提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 ICR小鼠共60只，雄性，4 w龄，18～22 g,购自吉林大学基础医学院实验动物中心。分别用于病毒免疫性实验(30只)和免疫保护试验(30只)，均在相同条件下饲养。

　　1.2 主要试剂及仪器细胞营养液(IMDM)、小牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、MTT、ConA、弗氏完全佐剂和HRP羊抗鼠IgG均为美国Sigma公司产品。EDTA和 ELISA用试剂为鼎国生物制品公司产品。OLYMPUSCKX41倒置显微镜，苏泰集团BHC1300ⅡA/B3生物安全柜，日本三洋MCO17AIC CO2培养箱和MDFU4086S型超低温冰箱。TECANA5082酶标检测仪，上海超高压仪器厂7000.55×1.5型静压机。

　　1.3 细胞株及病毒株流感病毒鼠肺适应株FM1和MDCK细胞株由吉林大学基础医学院病原生物学教研室分子病毒研究室保存。经MDCK细胞扩增后，病毒装入无菌塑料袋，放入用于超高压的静压机，在300 mPa，保压2.5 h进行病毒的灭活，灭活的流感病毒分装后，放入-70℃保存，待用。

　　1.4 病毒免疫性实验 30只ICR小鼠随机分为压力灭活组、病毒对照组和正常对照组，每组10只，超高压灭活病毒组每只皮下注射经超高压灭活的病毒0.2 ml(病毒与弗氏完全佐剂1∶1混合)，病毒对照组每只皮下注射病毒液0.2 ml(病毒与弗氏完全佐剂1∶1混合)，正常对照组每只皮下注射等量生理盐水，服次免疫后5 d处死小鼠，收集血液分离血清，无菌取脾脏，用于抗体检测和T淋巴细胞转化试验。

　　1.5 抗体检测采用间接ELISA法，将免疫后压力灭活组和正常对照组的小鼠血清均进行倍比稀释，按实验步骤，反应终止时，测OD492值。

　　1.6 T淋巴细胞转化试验采用MTT法，无菌取小鼠脾脏，调细胞浓度为5×106/ml，加入ConA 0.1 ml/孔，培养48 h，再加人MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，继续孵育4 h，加人DMSO 100 μl/孔，测OD570值，按下述公式计算刺激指数(SI)：SI=ConA刺激孔OD值/对照孔OD值。

　　1.7 免疫保护试验另用30只ICR小鼠随机分成正常对照组、病毒对照组和压力灭活组，每组10只。其中压力灭活组小鼠皮下注射0.2 ml灭活流感病毒(病毒与弗氏完全佐剂1∶1混合)，其他两组同时注射等量生理盐水。第二次免疫后5 d，正常对照组小鼠每只以0.2 ml生理盐水滴鼻，其他两组以0.2 ml未经超高压处理的流感病毒液滴鼻感染小鼠，感染后7 d，各组小鼠称重，脱颈处死，取肺，计算肺指数和肺指数抑制率。肺指数=肺重量(g)/体重(g)×100;肺指数抑制率=病毒对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数×100%。

　　1.8 统计学处理数据采用x±s表示，应用t检验进行比较。

　　2 结果

　　2.1 抗体检测结果间接ELISA结果显示，小鼠再次免疫5 d后，在1∶3 200～1∶25 600血清稀释度，压力灭活组和病毒对照组的抗体含量与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)，见表1。

　　2.2 T淋巴细胞转化实验结果压力灭活组和病毒对照组T淋巴细胞SI分别为2.92±0.31及2.89±0.21，与正常对照组(1.73±0.17)比较有显著性差异(P<0.01)。

　　2.3 免疫保护试验压力灭活组小鼠肺指数为0.723±0.16，肺指数抑制率为37.4%，与病毒对照组肺指数(1.155±0.14)比较有显著性差异(P<0.01);正常对照组(0.656±0.049)与病毒对照组比较也有显著性差异(P<0.01);压力灭活组与正常对照组比较无明显差异(P>0.05)。　　表1 加强免疫5 d三组不同血清稀释度的抗体水平

3 讨论

　　国内外学者对许多动物病毒研究表明，超高压可以通过使病毒表面结构发生轻微改变而使其感染性丧失，但超高压只改变蛋白质类抗原物质的空间结构，保留了一级结构的完整性，没有引起共价键的破坏，而蛋白质的一级结构中共价结构的完整性是其免疫原性所必需，因此超高压后病毒的抗原决定簇没有丢失，所以仍具有与未经超高压处理的病毒一样的免疫原性〔7，8〕。

　　本文采用超高压技术灭活流感病毒FM1株，并对其免疫原性进行了检测。抗体检测结果表明用超高压处理的病毒免疫小鼠，其特异性抗体产生量与正常对照小鼠之间存在显著差异，与未经超高压灭活的病毒组产生的抗体效价相近，表明用超高压处理的流感病毒FM1株免疫小鼠，产生了有效的体液免疫应答，而且与未经超高压处理的病毒相比免疫原性没有改变。T淋巴细胞转化试验可以间接体现T淋巴细胞识别特异性抗原的能力。用超高压灭活的病毒免疫后的小鼠淋巴细胞的刺激指数显著增高，表明在超高压灭活病毒的作用下，小鼠T淋巴细胞具有较强的增殖分化能力。

　　本文用免疫保护试验进一步证实了超高压处理的流感病毒FM1株的免疫效果。流感病毒感染可引起小鼠病毒性肺炎，炎性渗出使肺重量增加，肺重量增加与肺炎的严重程度呈正相关，结果显示超高压处理的病毒组肺指数显著低于病毒对照组，但与正常对照比较无显著差异，证实了超高压处理的流感病毒FM1株保留了与未经超高压处理病毒相似的免疫原性，诱导机体产生了针对流感病毒有效的特异性的免疫应答，清除了入侵的流感病毒，有效的避免了小鼠病毒性肺炎的发生。

　　长期以来热力、化学等方法在疫苗制备上一直被普遍应用，但这些技术都存在一些弊端〔9，10〕，例如对病毒结构破坏较大，化学制剂的副作用等。由于超高压比热力和化学因素更易控制，作用温和，因此灭活病毒不会引起表面抗原的过度变性或抗原决定簇的丢失，而且完整病毒颗粒的免疫效果更接近于有感染性的病毒体，因此超高压技术灭活的病毒，如用于疫苗的生产，将会带来更有效的免疫，为将来探讨用超高压技术制备全病毒灭活疫苗提供了可供参考的实验数据。

【参考文献】
　　1 Hampson AW.Vaccines for pandemic influenza.The History of our current vaccines，their limitations and the requirements to deal with a pandemic threat〔J〕.Ann Acad Med Singapore，2008;37(6):5107.

　　2 Kevin R，Gloria C，Meade K,et al.Highpressure inactivation of hepatitis A virus within oysters〔J〕.Appl Environl Microbiology，2005;71(1)：33943.

　　3 Bradley D，Hess R,Tao F,et al.Pressure cycling technology：a novel approach to virus inactivation in plasma〔J〕.Transfusion，2000;40(2)：193200.

　　4 Silva J,Foguel D,Royer C.Pressure provides new insights into protein folding〔J〕.Trends Biochem Sci，2001;26(10)：6128.

　　5 Silva J，Luan P，Glaser M,et al.Effects of hydrostatic pressure on a membraneenveloped Virus：high immunogenicity of the pressureinactivated virus〔J〕.Virology，1992;66(4)：21117.

　　6 Otake T，Kawahata T.Novel method of inactivation of human immunodeficiency virus type 1 by the freeze pressure generation method〔J〕. Appl Microbiol Biotechnol，2005;67(6):74651.

　　7 周密，李凡，郑贤红，等.超高压用于病毒减毒及灭活的研究〔J〕.中国生物制品学杂志，2008;21(2)：1479.

　　8 Gaspar LP，Mendes YS，Yamamura AM,et al.Pressureinactivated yellow fever 17DD virus：Implications for vaccine development〔J〕.J Virol Methods，2008;150(12)：5762.

　　9 Ishimaru D,SaCarvalho D,Silva J.Pressureinactivated FMDV：a potential vaccine 〔J〕.Vaccine，2004;22(1718)：23349.

　　10 Palache B.New vaccine approaches for seasonal and pandemic influenza〔J〕.Vaccine，2008;26(49)：62326.